Cómo validar un método dentro de tu laboratorio sin derramar una lágrima

Escrito por: Oscar Delgado
He sido analista, director técnico y jefe de laboratorio por más de 10 años. En la actualidad soy el director y fundador de SGC-Lab, donde acompañamos a los laboratorios de ensayo y calibración para que implementen con éxito la norma ISO/IEC 17025 sin necesidad de quebrarse la cabeza.

Uno de los dolores de cabeza dentro de los laboratorios es la verificación y validación de métodos, y el malestar se presenta porque no existe una receta única para realizar la tarea. Nuestro cerebro odia la incertidumbre, queremos que todo sea fácil y rápido.

Pero calma, que cunda el pánico!

A pesar de ser actividades que dependen de las necesidades de cada laboratorio, existen algunas cosas que le aplican a casi todos los métodos de ensayo.

Con seguridad que has escuchado hablar de veracidad, precisión, linealidad, sensibilidad, selectividad, entre otras. Estas son las características de desempeño del método y se deben evaluar dentro de la validación y algunas de ellas en la verificación.

La validación y la verificación son un plan o un protocolo establecido con el fin de evaluar las características de desempeño de un método analítico. ¿Parece sencillo verdad?

Como todo en la vida, decirlo es más fácil que hacerlo, pero no te preocupes, en esta guía te voy a explicar cómo se hace!

En este post no voy a entrar en detalle acerca de las definiciones técnicas, más bien lo que haré es ir al grano, decirte el cómo se hace sin darle tantas vueltas al molino.

Empecemos!

¿Cuáles son las características mínimas que debes evaluar en la validación de un método? 

Fuente: Eurachem

Este ejemplo es aplicado al sector farmacéutico, pero es válido para otros sectores como el de alimentos, aguas, suelos, etc.

Si tu método es un método normalizado solo tienes que evaluar la precisión (repetibilidad y precisión intermedia) y la veracidad como sesgo. Hechas estas dos tareas tendrás lista la verificación de tu método!

A continuación verás cada característica de desempeño y la forma de evaluarla dentro de tu laboratorio, en algunas de ellas existen más de una forma de hacerlo, tú decides con cual te quedas.

 

La veracidad

 

La veracidad indica que tan cerca está el resultado de un valor de referencia. La medida cuantitativa para evaluar la veracidad es el sesgo.

Antes de adentrarnos en los pasos para calcular el sesgo, quiero que nos pongamos de acuerdo en que la exactitud no significa veracidad, son dos cosas distintas. La exactitud hace referencia a cuan cercano está el resultado del valor verdadero.

La exactitud junta la veracidad y la precisión y se expresa mediante la incertidumbre de la medición.

Volviendo al tema del sesgo, éste se puede expresar de tres maneras distintas, veamos cada una de ellas:

 

Evaluación del sesgo utilizando materiales de referencia certificados MRC

 

Debes usar un MRC que sea igual o muy similar a las muestras de tu interés. El sesgo se calcula como:

Ecuación 1

Donde b es el sesgo (esto es porque en inglés se conoce como bias), X barra es el promedio de tus mediciones y Xref es el valor de referencia de tu MRC.

Diseño experimental

  • Mide 10 veces el MRC con el método a validar o verificar
  • Calcula el promedio de los resultados
  • Calcula el sesgo utilizando la ecuación 1

 

Evaluación del sesgo por comparación con un método oficial, validado o estandarizado

 

En este caso debes analizar la muestra con el método que deseas validar y con el método estandarizado. También puedes utilizar un material de referencia que no necesita ser un MRC.

Antes de empezar con el protocolo debes de contar con un método estandarizado adecuado. Para que sea adecuado debe provenir de una fuente confiable y poseer un sesgo bien definido.

Una vez cuentes con esta información replica los siguientes pasos:

1. Analiza 10 muestras por duplicado con el método a validar como con el método estandarizado.

2. Compara ambos grupos de resultados mediante un análisis de varianza ANOVA. Este paso es importante para determinar que no existen diferencias significativas entre los dos grupos.

3. Usa la ecuación 1 para calcular el sesgo. Ten presente que el valor de referencia será el promedio obtenido con el método oficial o de referencia.

Evaluación del sesgo mediante la adición de estándar (porcentaje de recuperación)

 

La adición de un estándar es otra de las metodologías que te sirve para determinar el sesgo de un método. La solución estándar es una solución de mesurando de concentración conocida preparada en el laboratorio u obtenida de una fuente confiable. Aquí tampoco es necesario que el material de referencia sea un MRC.

Existen dos maneras de hacerlo: Usar un placebo  o usar una muestra. Miremos cada una a continuación.

 

Usando un placebo

 

La podemos resumir en los siguientes pasos:

  1. Prepara el placebo

El placebo es una solución que contiene todos los componentes de la matriz del mesurando, exceptuando el mesurando.

  1. Enriquece el placebo con solución estándar

Una vez preparado el placebo se procede a enriquecerlo agregando la solución estándar.

La literatura propone preparar tres niveles de concentración a partir de la solución estándar y el placebo: 80%, 100% y 120% de la concentración normal de trabajo.

En cada nivel se recomienda preparar al menos tres replicas.

  1. Lleva a cabo un procedimiento de porcentaje de recuperación.

Una vez preparadas las soluciones de placebo enriquecidas con la solución estándar se procede a analizarlas mediante el método a validar.

Con los resultados obtenidos podrás calcular los porcentajes de recuperación así:

Ecuación 2

Donde R´ es el porcentaje de recuperación, X barra prima es el promedio de la muestra adicionada, X barra es el promedio de la muestra sin adicionar y Xadición es la concentración añadida.

 

Usando una muestra

 

En ocasiones no es posible obtener o preparar un placebo. En estas circunstancias debes determinar la concentración promedio del mesurando mediante el método a validar. Lo puedes ver en los siguientes pasos:

  1. Determina la concentración promedio del mesurando.

Esta determinación se realiza por duplicado.

  1. Enriquece la muestra con solución estándar.

Cuando se determina la concentración promedio se procede a enriquecer la muestra con la adición del estándar.

Al igual que en el caso del placebo, se recomienda preparar muestras enriquecidas con el estándar a tres niveles de concentración del valor normal de trabajo.

  1. Analiza y obtén el porcentaje de recuperación empleando la ecuación 2.

Cuando se trabaje con la muestra enriquecida se requiere contar con los datos del contenido del mensurando en la muestra antes de la adición del estándar. Esto para llevar a cabo el cálculo del porcentaje de recuperación.

La evaluación del sesgo empleando un MRC (situación 1) es suficiente si el objetivo es la verificación de un método normalizado, en caso de que el objetivo sea la validación del método te recomiendo emplear las tres formas de evaluación del sesgo.

La precisión

 

La precisión es una medida de cuan cerca están los resultados entre sí. Se evalúa a partir de parámetros estadísticos que describen la propagación de los resultados. La desviación estándar o desviación estándar relativa es el parámetro estadístico usado generalmente.

Existen diferentes formas para determinar la precisión y hay diversas consideraciones a tener en cuenta para llevar a cabo una correcta metodología.

A continuación te indico algunas de las consideraciones más importantes a tener en cuenta antes de llevar el protocolo relacionado:

  • La precisión está directamente relacionada con la concentración del mesurando y debe ser calculada dentro de un rango de concentraciones de interés.
  • Para evaluar la precisión es necesario realizar replicas en materiales adecuados de ensayo.
  • Los materiales de ensayo deben representar las muestras de ensayo. No necesariamente deben ser materiales de referencia certificados.
  • Además de esto, cada replica debe ser independiente. Esto indica que toda la metodología de medición debe repetirse.
  • El número mínimo de repeticiones a realizar está típicamente entre 6 y 15 para cada material en el estudio realizado.

Una vez entendidas estas consideraciones debes  llevar a cabo el protocolo para evaluar la precisión. Este protocolo puede comprender dos variables:

  • Repetibilidad
  • Precisión intermedia

Estas dos variables se pueden calcular por separado o ambas en un mismo protocolo o metodología.

A continuación te explicaré el protocolo simple que se usa para calcularlas por separado:

 

La repetibilidad

 

  1. Prepara de 6 a 15 muestras que comprendan todo el rango del intervalo de trabajo.
  2. Mide cada una de las muestras.

Este proceso de medición debe cumplir con las siguientes condiciones:

  • Se debe usar un mismo equipo
  • La medición la debe hacer un mismo analista
  • Se debe hacer en un mismo laboratorio
  • El procedimiento se realiza en periodo de tiempo corto
  1. Una vez realizada la medición se procede a determinar la desviación estándar o el coeficiente de variación.

La desviación estándar se puede calcular con facilidad en excel, así que no voy dejarte la formula porque asumo que ya la conoces. Para calcular el coeficiente de variación  solo divide la desviación estándar entre el promedio de los datos, o si lo quieres en porcentaje solo multiplica por 100.

 

La precisión intermedia

 

Comprende los mismos pasos que el protocolo para calcular la repetibilidad con la excepción de que las condiciones de medición son distintas. Para esto la medición se debe hacer siguiendo las siguientes consideraciones:

  • Usar analistas y equipos diferentes
  • Realizar la medida dentro de un mismo laboratorio
  • El procedimiento se realiza en periodo de tiempo corto

Nota: A veces no es posible realizar las mediciones en equipos distintos, por lo que se acepta variar el tiempo, es decir, puedes hacer las mediciones en días diferentes, por ejemplo durante 6 días.

 

La linealidad e intervalo de trabajo

 

La linealidad de un método debe ser demostrada dentro del intervalo de trabajo más probable. Este intervalo varía dependiendo del tipo de medición a realizar.

En el cálculo de la linealidad e intervalo de trabajo debes considerar dos componentes: El sistema y el método. A cada uno de estos componentes se le debe  calcular la linealidad e intervalo de trabajo.

No te asustes, te lo muestro a continuación.

Linealidad e intervalo de trabajo del sistema. Los pasos a seguir para determinar estas variables asociadas al sistema se resumen en la siguiente lista:

 

  1. Prepara soluciones de estándar de al menos 5 niveles de concentración. Cada nivel de concentración es independiente de otro. Las soluciones deben estar comprendidas dentro del rango del intervalo de trabajo.
  1. El paso anterior se repite de forma independiente por lo menos 3 veces.
  1. Realiza una gráfica que relacione la respuesta de medición versus la concentración del mesurando. En caso de contar con mediciones atípicas es necesario realizar mediciones adicionales.
  1. Realiza un análisis de varianza de las regresiones lineales obtenidas.
  1. Procede a calcular el coeficiente de regresión. Se debe hacer este procedimiento para las tres regresiones lineales obtenidas.
  1. Por último calcula y grafica los valores de los residuos.

 

Los residuos se obtienen restando el valor real de la concentración menos el valor determinado a partir de la ecuación de la regresión lineal correspondiente.

 

Linealidad e intervalo del método. Los pasos a seguir para determinar la linealidad e intervalo de trabajo del método son los mismos mostrados para el caso de la linealidad e intervalo del sistema.

Solo tenemos una excepción en el primer paso. En vez de preparar las soluciones con estándar, las prepararemos con muestra o con placebos enriquecidos.

 

Criterios de aceptación. Los criterios que debe cumplir un sistema o método para que tenga un comportamiento lineal son:

 

  1. Poseer una varianza constante para todas las concentraciones.
  1. La recta de la regresión lineal debe pasar por cero. Esto se deduce a partir de una prueba de student con un intervalo de confianza del 95%.
  1. Tener una desviación que sea insignificante respecto de la regresión.
  1. Los valores de los residuos deben de presentar una distribución aleatoria. Cuando se presentan valores sistemáticos hay una probabilidad alta de tener una no linealidad.
  1. Tener un coeficiente de correlación entre 0.98 y 1. Por su parte, el valor del coeficiente de correlación elevado al cuadrado debe ser mayor a 0.995.

En esta grafica tomada de guía Eurachem puedes ver dos ejemplos. En el ejemplo A tienes una curva obtenida mediante un método instrumental donde se puede ver con claridad el LOD, LOQ  y el intervalo lineal. En el ejemplo B están graficados los residuos, es decir, la concentración teórica preparada (eje x) y la concentración medida (eje y).

 

El límite de detección

 

El límite de detección LOD es la cantidad más baja del mensurando que puede ser detectada con cierto nivel de confianza.

Para evaluar el LOD sigue estos pasos:

  • Prepara mínimo 10 soluciones de blanco independientes, es decir, muestras que no contengan el mensurando en cantidades detectables
  • Analiza cada una de las muestras obtenidas con el método a validar
  • Calcula la desviación estándar So

El cálculo del límite de detección se obtiene de una expresión tan sencilla como la siguiente:

La guía de la Eurachem recomienda corregir la desviación estándar para calcular el límite de detección y de cuantificación, para ello solo aplica el siguiente razonamiento y usa las ecuaciones de la gráfica:

Fuente: Eurachem

El límite de cuantificación

 

El límite de cuantificación LOQ es la cantidad mínima que puede ser cuantificada con cierto nivel de confianza.

Esta variable se puede determinar a partir del valor conocido del límite de detección. Generalmente se obtiene al multiplicar el valor del límite de detección por un factor, dependiendo del tipo de análisis a realizar.

Usa la siguiente ecuación:

LOQ = 10 x LOD

En la práctica suele pasar que el LOQ encontrado con la ecuación anterior no cumple los criterios especificados para la precisión y la veracidad, en estos casos te recomiendo evaluar el LOQ de forma experimental preparando blancos o matrices fortificadas con el mensurando a muy bajas concentraciones, e ir viendo cual es la concentración más baja que cumple los requisitos de precisión y veracidad.

Para conocer más sobre el límite de detección y cuantificación te recomiendo este artículo que escribí hace un tiempo, ahí te muestro más detalles que no se pueden cubrir en este post.

 

La selectividad

 

En la guía de validación de métodos de la Eurachem se define a la selectividad como: El grado en el que un método puede ser utilizado para determinar analitos particulares en mezclas o matrices sin interferencias de otros componentes de comportamiento similar.

También la podemos encontrar con el nombre de especificidad o especificidad analítica.

Para evaluar la selectividad puedes adicionar a las muestras de manera intencional las interferencias que se creen pueden estar presentes en la matriz, es decir, hay que contaminar la muestra con varias interferencias.

Cuando no se sabe si las interferencias están presentes o no, la selectividad se puede evaluar comparando el método a validar con otros métodos que sean independientes.

¿Cómo se realiza la evaluación de la selectividad? Existen dos opciones:

Opción 1. Estamos seguros de que hay interferencias dentro de la matriz que contiene al mensurando.

En este caso debes  evaluar la habilidad del método para medir el mensurando de interés. El analito está contenido dentro de una matriz a la cual se le ha añadido las interferencias que es posible que encontremos comúnmente en la muestra.

 

Procedimiento

 

  1. Analiza las muestras de ensayo una vez. Durante este análisis deben estar las interferencias.
  2. Determina si la presencia de las interferencias inhibe la detección o cuantificación del mensurando.

Opción 2. Aquí no tienes la seguridad de saber si las interferencias están presentes o no en la matriz que contiene al mensurando.

Aquí debes  realizar una prueba confirmatoria que consiste en utilizar métodos adicionales independientes del método a validar.

 

Procedimiento

 

  1. Analiza las muestras de ensayo y el material de referencia por el método a validar.
  1. Analiza las muestras y el material de referencia por otros métodos independientes.
  1. Usando un método o varios métodos confirmatorios debes confirmar la presencia del mensurando en los pasos 1 y 2.
  1. Con los datos obtenidos evalúa la capacidad del método para confirmar la identidad del mensurando.
  1. También evalúa su capacidad para medir el mensurando aislado de otras interferencias.

En este caso se debe decidir cuanta información es necesaria para confirmar la confiabilidad del método.  

 

Conclusión

 

Validar un método no es tan difícil, solo tienes que sabes cuales son los requisitos de tu laboratorio, los reglamentarios y los de tu cliente. Con esta información ya puedes decidir cuáles serán las características de desempeño que vas a evaluar y en qué extensión.

Si el método es un método normalizado solo tienes que evaluar la veracidad y la precisión para confirmar el método. Ahora bien, si quieres evaluar más características de desempeño no hay problema.

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Hasta la próxima!

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8 Comentarios

    • Oscar Delgado

      Hola Félix. Este curso estará disponible para febrero del 2021. Saludos!

      Responder
  1. BERNARDO RIVERA FONSECA

    La narración anterior se puede considerar como un procedimiento para validar cualquier método en el laboratorio de ensayos?

    Responder
    • Oscar Delgado

      Hola Bernardo. Es correcto, puedes usar la guía para validar tus métodos en el laboratorio. Saludos!

      Responder
    • Laura

      Buen día, primero de todo, gracias por explicarlo todo tan fácil. Me encanta el primer párrafo del texto, define tan bien como siento en lo que podría llamar mi primer proceso de validación….una incertidumbre detrás de otra. Ahora mismo tengo serias dudas acerca de la recta de calibración, en concreto en la pendiente. Cómo sé que la pendiente es la adecuada? Es decir, yo hoy puedo preparar una recta que todos los parámetros de aceptación estén ok, y me da una pendiente x, y a lo mejor mañana preparo otra «igual», y me da otra pendiente (no mucho, de 0.61 a 0.59 por ejemplo, y tb el termino independiente)…. con lo cual los valores interpolados, sobretodo en el rango alto, serán distintos… Qué margen de variación es admisible? Cómo demuestro que ambos resultados son válidos? Sobretodo cuando paso un control de recta… puede entrarme en el rango establecido o no, simplemente dependiendo de la pendiente que tenga la recta, que a priori yo pensaba que estaba Ok porque residuales, r y r2 eran adecuados etc. Muchas gracias, pondré el blog en favoritos porque la verdad es de mucha ayuda.

      Saludos, Laura

      Responder
      • Oscar Delgado

        Hola Laura, un gusto saludarte. Existen un par de requisitos estadísticos para las curvas de calibración que te permiten saber si una curva de calibración está bien o mal construida, dado que el r o r cuadrado no son suficientes, pero queda fuera del alcance de este espacio explicártelo, por lo tanto te invito a tomar el curso de validación de métodos que inicia 1 de noviembre. Saludos!

        Responder
  2. Noe Paxtian

    Excelente información.
    Gracias.
    Saludos

    Responder
    • Oscar Delgado

      Muchas gracias a ti por seguir el blog. Saludos!

      Responder

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